Флуоресцентные наборы для иммунофлуоресцентной окраски двойного и тройного окрашивания (TSA) от компании Servicebio

Набор реагентов TSAPLus предназначен для двойной иммунофлуоресцентной окраски (IF488+ Red IF555) парафиновых срезов, в частности для двойной флуоресцентной иммуноразметки первичных антител из одного источника, а также для иммуноразметки антител из разных источников.

Основной принцип состоит в технологии усиления сигнала тирамида (TSA, Tyramide Signal Amplification). Принцип TSA заключается в применении пероксидазной реакции тирамида (флуоресцентно меченая соль тирамида образует ковалентную связь с участками связывания под действием HRP-катализированного пероксидом водорода (H₂O₂)), что приводит к множественным ферментативным реакциям. Продукт связывается с окружающими белковыми остатками (в том числе триптофан, гистидин и тирозин), формируя большое количество флуоресцентных отложений в месте связывания антигена с антителом, что способствует усилению сигнала.

Множественное флуоресцентное окрашивание также возможно за счёт повторной иммуноразметки с использованием различных флуоресцентных тирамидаз.

Если сравнивать с другими флуоресцентными наборами двойного окрашивания TSA, данный набор заменяет FITC-Tyramide и CY3-Tyramide на iF488-Tyramide и iF555-Tyramide, обеспечивая сильнее и стабильнее флуоресцентные сигналы.

Данные спектра флуоресценции соответствующих флуоресцентных красителей в наборах TSA

Условия хранения и транспортировки

Каждый компонент набора хранится при рекомендуемых условиях. Комплект транспортируется на влажном льду. Срок годности — 1 год.

Состав набора

Подготовка к эксперименту

• Приготовить 0,01 М фосфатно-солевой буфер (PBS) (рН 7,0-7,4), 3% H₂O₂ и 0,3% H₂O₂.
• Приготовить первичные антитела и соответствующие HRP-меченные вторичные антитела, а также раствор для восстановления антигена (выбрать подходящий в зависимости от типа ткани и антитела).
• В соответствии с таблицей ниже приготовить рабочий раствор TSA для окрашивания.

• После размораживания флуоресцентного тирамида пробирку кратковременно центрифугируют, затем тщательно перемешивают.
• Раствор TSA готовится непосредственно перед использованием, хранится в тёмном месте при 4 °С и остаётся эффективным в течение 24 часов.
  

Экспериментальный протокол (пример для тканевых срезов)

• Обезвоживание и гидратация срезов.
• Реставрация антигена: в зависимости от используемого первичного антитела и типа ткани выбирают подходящий метод.
• Промывка PBS: 3 раза по 5 минут, затем нанесение защитной маркировки (используйте гидрофобный маркер для иммуногистохимии Pap Pen).
• Блокирование эндогенной пероксидазы: покрыть ткани 3% H₂O₂, инкубировать 25 минут в темноте при комнатной температуре. Промыть PBS 3 раза по 5 минут.
• Блокирование неспецифического связывания: нанести 3% BSA или сыворотку на 30 минут.
• Инкубация с первичным антителом: развести антитело в PBS, инкубировать в увлажнённой камере при 4 градусах на ночь. Промыть PBS 3 раза по 5 минут.
• Инкубация с HRP-меченным вторичным антителом: развести в PBS, инкубировать 50 минут при комнатной температуре. Промыть PBS 3 раза по 5 минут.
• Окрашивание TSA-488: нанести 50-100 мкл раствора, инкубировать 10 минут в темноте. Промыть PBS 3 раза по 5 минут.
• Тепловая обработка в микроволновке: помещают срезы в буфер восстановления антигена, нагревают до 95 градусов на 15 минут.
• Повторная инкубация со вторым первичным антителом: аналогично шагу 6.
• Повторная инкубация с HRP-меченным вторичным антителом: аналогично шагу 7.
• Окрашивание TSA-555: аналогично шагу 8.
• Окрашивание ядра DAPI: инкубация 10 минут в темноте, промывка PBS.
• Гашение аутофлуоресценции (опционально): обработка судановым черным (Sudan Black B) 5 минут, промывка проточной водой 3 минуты.
• Закрепление и микроскопия: нанести антифлуоресцентный гаситель, запечатать срез, наблюдать под флуоресцентным или конфокальным микроскопом.

Примечания

• По сравнению с флуоресцентными вторичными антителами, набор TSA обеспечивает высокую чувствительность и мощный сигнал, поэтому концентрацию первичного антитела следует уменьшить в 5-10 раз по сравнению с обычными рекомендациями.
• При сильном фоновом свечении добавить этап гашения аутофлуоресценции.
• Рекомендуемое разведение флуоресцентного тирамида — 1:500 (можно варьировать от 1:200 до 1:1000).
• При множественной флуоресцентной окраске сначала инкубируют поликлональное антитело, затем моноклональное. Также сначала обрабатывают высокоэкспрессируемые белки, затем низкоэкспрессируемые.

Набор предназначен для многоцветного иммуногистохимического флуоресцентного окрашивания парафиновых срезов, особенно для иммуноокрашивания первичных антител из одного источника.

Принцип работы набора основан на технологии усиления сигнала тирамида (TSA). В процессе каталитической активности HRP (хреновой пероксидазы) флуоресцентно-меченный тирамин также катализируется, его продукты связываются с белковыми остатками (триптофан, гистидин, тирозин) в области связывания антигена и антитела, что усиливает сигнал.

Этот набор использует флуоресцентные красители 488/555/647 для мечения тирамида. Полученные флуоресцентные молекулы обеспечивают стабильный и яркий сигнал, что позволяет проводить повторное иммуномечение для многократного флуоресцентного окрашивания.

Флуоресцентный спектр используемых красителей

Условия хранения и транспортировки

Каждый компонент набора хранится при рекомендуемых условиях. Комплект транспортируется на влажном льду. Срок годности — 1 год.

Состав набора

Подготовка к эксперименту

• Приготовьте 0,01 моль/л PBS (pH 7,0-7,4) (рекомендуется G4202 или G0002), 3% H₂O₂ и 0,3% H₂O₂.
• Подготовьте первичные антитела, соответствующие HRP-меченные вторичные антитела и раствор для восстановления антигена (подбирается в зависимости от антитела и типа ткани).
• Подготовьте рабочие растворы TSA в соответствии с таблицей:

Примечание: перед использованием центрифугируйте флуоресцентный тирамид. Готовый рабочий раствор храните при 4 градусах в темноте, использовать в течение 24 часов.

Применение

• Подготовка образца: депарафинизация и регидратация тканевого среза стандартным методом IHC.
• (Опционально) Восстановление антигена: обработка ткани в растворе для восстановления антигена, затем промывка PBS (3×5 мин).
• Ограждение области ткани: используйте гидрофобный маркер для иммуногистохимии Pap Pen.
• (Опционально) Гашение аутоглюоресценции: нанесение 100 мкл раствора A на 30 мин, затем промывка.
• Блокирование эндогенной пероксидазы: 3% H₂O₂ на 25 мин в темноте.
• Блокирование неспецифического связывания: 100-150 мкл 3% BSA или сыворотки на 30 мин.
• Окрашивание 1-м флуорофором (488)
• Инкубация с первичным антителом (4 градуса, в темноте).
• Промывка PBS (3×5 мин).
• Инкубация с HRP-меченным вторичным антителом (50 мин, комнатная температура).
• Промывка PBS (3×5 мин).
• Инкубация с TSA-488 (10 мин в темноте), затем промывка.
• Тепловая обработка: удаление антител и повторное окрашивание вторым антителом.
• Окрашивание 2-м флуорофором (555): повторение шага 7 с TSA-555.
• Окрашивание 3-м флуорофором (647): повторение шага 7 с TSA-647.
• Контрастное окрашивание ядер: 100-150 мкл DAPI (10 мин, в темноте).
• Промывка PBS (3×5 мин).
• (Опционально) Повторное гашение аутоглюоресценции: обработка раствором B (30 мин), затем промывка.
• Анализ: монтирование покровного стекла с антифлуоресцентным агентом и визуализация на микроскопе.

Примечания

• Последовательность окрашивания (488, 555, 647) можно менять.
• Оптимизируйте условия эксперимента для максимальной специфичности сигнала.
• Возможные проблемы и их решения: