Разделяй и властвуй. Как технология цифровой ПЦР позволяет уверенно контролировать точность результатов молекулярно-генетических исследований

За более чем 30-летнюю историю своего существования метод полимеразно-цепной реакции (ПЦР) постоянно эволюционировал, расширяя возможности и сферы своего применения. Первое поколение ПЦР (ПЦР по конечной точке, «классическая» ПЦР) для анализа накопленных продуктов использует гель-электрофорез, что ограничивает метод низким пределом обнаружения, трудоемкостью процедуры и, по сути, возможностью только качественного анализа. Второе поколение ПЦР (количественная ПЦР, реал-тайм) позволяет количественно определять продукты, однако только при наличии референсных или стандартных образцов, а также демонстрирует низкую толерантность к ингибиторам, влияющих на эффективность реакции. Несмотря на огромную популярность реал-тайм, как метода определения нуклеиновых кислот во многих клинико-диагностических направлениях, возникла необходимость улучшения точности технологии для детекции единичных копий или низких концентраций нуклеиновых кислот в образцах.

Цифровая ПЦР (цПЦР) — это третье поколение ПЦР, которое является эволюционным продолжением двух предыдущих технологий и инкорпорирует их основные принципы. Так, в цПЦР детектируется флуоресцентный сигнал по конечной точке, то есть после завершения реакции амплификации. Однако уникальные возможности цифровой ПЦР обусловлены совершенно новым подходом к реализации формата проведения анализа.

Анализируемый образец физически разделяется на тысячи отдельных микрореакций, в каждой из которых может пройти амплификация искомой мишени при её попадании в микрореакцию. Положительным событием будет считаться детекция сигнала при амплификации мишени, отрицательным — отсутствие такого сигнала. Вероятность распределения мишени в образце по отдельным микрореакциям (при достаточно большом количестве этих микрореакций) математически описывается распределением Пуассона, что делает возможным рассчитать концентрацию ДНК-мишени в образце.

Возможность абсолютной количественной детекции копий ДНК, не требующая использования стандартов или референсных последовательностей, обеспечивает безусловное преимущество цПЦР в таких приложениях, как расчет вирусной нагрузки в образце, создание стандартов, мониторинг остаточной болезни и т.д. Другим существенным аргументом в пользу нового метода является улучшение предела детекции вследствие повышения эффективной концентрации молекул мишени в малом объеме реакций. Это позволяет с большей уверенностью проводить амплификацию единичных молекул ДНК и детектировать их в образце. Кроме того, уменьшение объема реакции приводит к снижению шума из-за конкуренции интерфирирующих агентов за связь с матрицей, что позволяет анализировать сложные образцы (из парафиновых блоков, частично деградированные), в которых зачастую присутствуют ингибиторы ПЦР. Такие преимущества позволили цПЦР стать незаменимым инструментом для решения задач, требующих особой точности при работе с низкокопийными матрицами. цПЦР вошла в рекомендации Европейской комиссии по науке как метод для диагностики онкологических заболеваний, пренатальной диагностики, измерению вирусной и бактериальной нагрузки, обнаружению ГМО, тестированию антимикробной резистентности.

Обзор системы 600 Digital PCR Analysis System, Maccura

Концепция цПЦР была предложена еще в начале 90-х (Sykes, P. J. et al. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. Biotechniques 13, 444–9 (1992)). Однако первая коммерчески доступная система была представлена только в 2011 году компанией Био-Рад (Bio-Rad Laboratories, Inc). Система QX100 позволяет осуществить разделение образца на 20 тысяч нанокапель (те самые микрореакции) посредством микрофлюидики и специально подобранного химического состава масла. В параллели стал развиваться еще один подход к получению тысяч отдельных реакций — с помощью чипов. К настоящему времени на рынок выведены десятки систем цифровой ПЦР различных производителей. Капельная цифровая ПЦР и цифровая ПЦР с использованием чипов имеют свои конкурентные преимущества. Несмотря на подход к реализации технологии, цПЦР обеспечивает непревзойденную чувствительность и точность анализа, при этом по скорости и простоте выполнения реакции совсем немногим уступая реал-тайм.

В настоящее время цПЦР активно используется как в научных, так и в клинических лабораториях и биотехнологических производствах для обнаружения остаточной ДНК, редких мутаций, изменения числа копий, мониторинга патогенной нагрузки, верификации NGS библиотек и многих других приложениях.

Диаэм рада объявить о сотрудничестве с компанией Maccura, ведущем производителем оборудования для клинической диагностики в Китае, и представить высокопроизводительную систему капельной цифровой ПЦР D600.

Уникальная технология OsciDrop, права на которую принадлежат Maccura, позволяет в течение десятка минут сгенерировать однородные по размерам нанокапли, равномерно распределенные по 96 лункам, без использования дополнительного оборудования.

Прибор представляет собой компактную систему, автоматически осуществляющую все операции на одном борту: генерация капель, термоциклирование, считывание сигнала. С помощью удобного интерфейса ПО легко запрограммировать реакцию и провести анализ результатов.

D600 — самое доступное производительное решение в России сегодня.

Абсолютная количественная оценка	Точность и чувствительность	Воспроизводимость результатов	Высокая эффективность и стабильность
Не требуется референсов и стандартов	Высокое соотношение сигнала к шуму Детекция одной копии	Надежность в повторных тестированиях	Толерантность к ингибиторам Для работы со сложными образцами

Собственная запатентованная технология MicroOsciDrop

Быстрота и однородность При генерации массива микрокапель используется оригинальная технология вибрации (OsciDrop), позволяющая быстро и стабильно генерировать однородные наноразмерные капли.	Стабильная амплификация мишени Капли генерируются ровным слоем, покрывая всю поверхность лунки планшета. Это обеспечивает равномерный прогрев, стабильную амплификацию и чувствительную детекцию ДНК-мишени. Вся процедура занимает всего 2,5-3 часа.
Мультиплекс Возможность одновременного определения до 6 мишеней, мощный источник света и ортогональная система детекции флуоресценции позволяют получать надежные результаты при мультиплексировании, экономя время и затраты на постановки.	Точный алгоритм Передовая технология планахроматическая коррекция флуоресценции и алгоритм распознавания массива нанокапель с глубоким обучением обеспечивает высокую точность детекции нанокапель, и улучшенное соотношение сигнал/шум.
Высокая производительность и экономия Гибкость выбора количества сгенерированных нанокапель на образец (от 5 до 20 тысяч) позволяет подстраивать дизайн исследования под задачи эксперимента и анализировать одновременно до 96 образцов, делая стоимость теста на один образец одной из самых доступных.	Линейка диагностических наборов Собственное портфолио диагностических наборов на вирусные и бактериальные инфекции; возможность заказа наборов для детекции мутаций, ассоцированных с риском развития опухолей, определения метилирования и копийности генов.

См. также:

ДНК амплификаторы в "реальном времени"
ДНК-амплификаторы "классические"
Выделение и очистка нуклеиновых кислот

Ниже вы можете задать вопрос или оставить запрос в свободной форме: