Секвенаторы ДНК 3-го поколения, нанопоровые Аксессуары

Набор предназначен для быстрого получения библиотеки из геномной ДНК с помощью простого 2-шагового протокола, пробоподготовка занимает не более 10 минут. Процесс основан на транспозазном расщеплении ДНК с последующей пришивкой сиквенсных адаптеров.

Особенности набора:

время пробоподготовки	10 минут
требуемое количество ДНК	400 нг высокомолекулярной ДНК
необходимость ПЦР	нет
фрагментация ДНК	транспозазная
длина рида	случайная, зависит от длины исходных фрагментов
производительность	1-2 гигабаз за 6 часов, 4-8 гигабаз за 48 часов
совместимые протоколы	Rapid Sequencing; Rapid whole genome amplification
количество библиотек	6
совместимость с проточными ячейками	FLO-MIN106D; FLO-MIN107

Набор предназначен для исследований, требующих простой пробоподготовки и быстрого результата, но не максимальной производительности секвенирования. Так как количество стадий пипетирования и время подготовки минимальны, набор даёт возможность получения длинных ридов, но макcимальная длина зависит от качества исходной ДНК. Поэтому для лучшего результата рекомендуется использовать ДНК со средней длиной фрагментов не менее 30 гигабаз. Для выделения высокомолекулярной геномной ДНК можно использовать набор Blood & Cell Culture DNA Mini Kit (Qiagen).

Рекомендуемое исходное количество ДНК — не менее 400 нг. Возможно получение библиотеки из меньшего количества ДНК, а также из фрагментированной ДНК, но производительность будет ниже. Для получения библиотеки из меньших количеств ДНК рекомендуется набор PCR Sequencing Kit и протоколы Low Input и Rapid Low Input.

Так как при получении библиотеки отсутствует стадия ПЦР, данный набор пригоден для выявления модифицированных нуклеотидов.

Дополнительные расходные материалы:

• 1,5 мл пробирки типа Эппендорф с низкой адгезивностью DNA LoBind (30108051);
• 0,2 мл тонкостенные пробирки для ПЦР PCR-02-C);
• вода, не содержащая нуклеаз (R0581).

Дополнительное оборудование:

• настольная микроцентрифуга (например, Eppendorf 5452000018);
• вортекс (например, Biosan BS-010203-AAG);
• амплификатор (например, Thermo Fisher Scientific A37834);
• набор автоматических пипеток переменного объёма — от 0,5 до 10 мкл (например, Eppendorf 3120000020), от 2 до 20 мкл, от 10 до 100 мкл (например, Eppendorf 3120000046), от 20 до 200 мкл (например, Eppendorf 3120000054) и от 100 до 1000 мкл (например, Eppendorf 3120000062);
• наконечники с фильтром к автоматическим пипеткам;
• таймер (например, TR118OS).

Опционально:

• флуориметр Qubit 4.0 или аналогичный.

Direct cDNA Sequencing Kit — набор для прямого секвенирования кДНК. Набор предназначен для секвенирования РНК через стадию синтеза кДНК без стадии ПЦР. С помощью набора Direct DNA Sequencing Kit можно:

• идентифицировать полноразмерные транскрипты и анализировать их количество;
• исследовать дифференциальную экспрессию генов;
• характеризовать транскрипционные изоформы, варианты с альтернативным спласингом и фьюжн-транскрипты;
• секвенировать полноразмерные кДНК без артефактов, вносимых на стадии ПЦР.

В состав набора входит Pro Flow Cell Priming Kit для загрузки библиотек в ячейку, совместимый с ячейками для PromethION

Особенности набора:

время пробоподготовки	от 270 минут
требуемое количество ДНК	100 нг полиА + РНК
необходимость обратной транскрипции	да
необходимость ПЦР	нет
длина рида	равна длине полных транскриптов
производительность	до 2 гигабаз за 6 часов, до 8 гигабаз и более за 48 часов
число ридов	5-10 миллионов полноразмерных кДНК
мультиплексирование	до 12 образцов, с Native Barcoding Expansion Pack 1-12 или 13-24
совместимые протоколы	Direct cDNA sequencing
количество библиотек	6
совместимость с проточными ячейками	FLO-MIN106D; FLO-PRO002 (PromethION)

Набор рассчитан на работу с поли-А+ РНК, но возможно также использование РНК со специфическими 3’-концевыми последовательностями (например, вирусной РНК). Для этого необходимы олигонуклеотиды, комплементарные этим последовательностям. Пробоподготовка заключается в синтезе комплементарной цепи кДНК с помощью обратной транскрипции. Обогащение библиотеки полноразмерными копиями происходит за счёт переключения цепей при обратной транскрипции (strand-switching). Затем цепь РНК расщепляется, и достраивается вторая цепь кДНК. Сиквенсные адаптеры лигируются на двухцепочечную кДНК (в нанопоры может проходить любая из цепей кДНК).

При работе с Direct cDNA Sequencing Kit предусмотрена возможность мультиплексирования с помощью наборов Native Barcoding Expansion 1-12 (EXP-NBD104) или Native Barcoding Expansion 13-24 (EXP-NBD105). В одну библиотеку может быть загружено до 12 образцов кДНК.

Дополнительные расходные материалы и реактивы:

• магнитные частицы Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter);
• набор для достройки концов ДНК NEBNext End repair / dA-tailing Module (New England Biolabs E7546);
• набор для лигирования NEB Blunt/TA Ligase Master Mix (New England Biolabs M0367);
• 1,5 мл пробирки типа Эппендорф с низкой адгезивностью DNA LoBind (Eppendorf 0030108051);
• 0,2 мл тонкостенные пробирки для ПЦР (Axygen PCR-02-C);
• вода, не содержащая нуклеаз (Thermo Fisher Scientific R0581);
• свежеприготовленный 70 % этанол;
• 10 мМ раствор dNTP (Thermo Fisher Scientific R0191);
• обратная транскриптаза Maxima H Minus (Thermo Fisher Scientific EP0751);
• ингибитор РНКаз RNAseOUT (Thermo Fisher Scientific 10777019);
• смесь РНКаз RNAse Cocktail Enzyme Mix (Thermo Fisher Scientific AM2286).

Дополнительное оборудование:

• настольная микроцентрифуга (например, Eppendorf 5452000018);
• вортекс (например, Biosan BS-010203-AAG);
• магнитный штатив (Диаэм 3336);
• ротационный перемешиватель (например, Elmi RM1L);
• амплификатор (например, Thermo Fisher Scientific A37834);
• набор автоматических пипеток переменного объёма - от 0,5 до 10 мкл (например, Eppendorf 3120000020), от 2 до 20 мкл (например, Eppendorf 3120000038), от 10 до 100 мкл (например, Eppendorf 3120000046), от 20 до 200 мкл (например, Eppendorf 3120000054) и от 100 до 1000 мкл (например, Eppendorf 3120000062);
• наконечники с фильтром к автоматическим пипеткам;
• термоконтейнер со льдом;
• таймер (например, TR118OS);
• охлаждающий штатив для пробирок на 0,2 мл (например, Eppendorf3881000031).

Опционально:

• флуориметр Qubit 4.0 (Thermo Q33227);
• система для фрагментного анализа (например, Qsep 100);
• наноспектрофотометр (например, NanoDrop 2000C).
  

Набор предназначен для прямого секвенирования РНК без стадии обратной транскрипции. С помощью набора Direct RNA Sequencing Kit можно:

• изучать модифицированные нуклеотиды и другие характеристики нативной РНК;
• секвенировать молекулы РНК, которые плохо подвергаются обратной транскрипции.

Особенности набора

время пробоподготовки	от 115 минут
требуемое количество ДНК	500 нг поли-А+ РНК
необходимость ПЦР	нет
обратная транскрипция	опциональная
длина рида	зависит от длины исходных фрагментов
производительность	до 1 гигабазы за 6 часов, 1-4 гигабазы за 48 часов
совместимые протоколы	Direct RNA Sequencing; Sequence-specific direct RNA sequencing*
мультиплексирование	на стадии разработки
количество библиотек	6
совместимость с проточными ячейками	FLO-MIN106D; FLO-MIN107

* Полные протоколы доступны на сайте www.nanoporetech.com для зарегистрированных пользователей-участников Nanopore Community.

Набор предназначен для работы с молекулами РНК, обладающими 3’-концевыми полиА –структурами — эукариотическими мРНК, полиаденилированными вирусными РНК или РНК, обработанными наборами для полиаденилирования. Для РНК без полиА-концов можно синтезировать пользовательские адаптеры, комплементарные 3’-концам (например, для тРНК или 16S-РНК).

В отличие от протоколов секвенирования кДНК, в случае использования набора Direct RNA Sequencing Kit происходит секвенирование нативных молекул РНК; только они проходят через поры проточной ячейки.

Стадия обратной транскрипции при пробоподготовке опциональна, но настоятельно рекомендуется — это повышает производительность секвенирования.

Набор Direct RNA Sequencing Kit незаменим в случае анализа модифицированных нуклеотидов. Если задача выявления таких нуклеотидов не ставится, рекомендуются наборы для секвенирования кДНК, так как они обеспечивают более высокую производительность.

Дополнительное оборудование:

• настольная микроцентрифуга (например, Eppendorf 5452000018);
• вортекс (например, Biosan BS-010203-AAG);
• магнитный штатив (Диаэм 3336);
• ротационный перемешиватель (например, Elmi RM1L);
• амплификатор (например, Thermo Fisher Scientific A37834);
• набор автоматических пипеток переменного объёма — от 0,5 до 10 мкл (например, Eppendorf 3120000020), от 2 до 20 мкл (например, Eppendorf 3120000038), от 10 до 100 мкл (например, Eppendorf 3120000046), от 20 до 200 мкл (например, Eppendorf 3120000054) и от 100 до 1000 мкл (например, Eppendorf 3120000062);
• наконечники с фильтром к автоматическим пипеткам;
• термоконтейнер со льдом;
• таймер (например, TR118OS);
• флуориметр Qubit 4.0 (Thermo Q33227).

Опционально:

• система для фрагментного анализа (например, Qsep 100);
• наноспектрофотометр (например, NanoDrop 2000C).

Набор предназначен для секвенирования двухцепочечной ДНК. Это наиболее универсальный набор из всех, предлагаемых Oxford Nanopore Technologies. С помощью набора Ligation Sequencing Kit можно:

• получить максимальную производительность секвенирования;
• контролировать длину секвенируемых фрагментов.

Для данного набора предлагается множество протоколов пробоподготовки библиотек из различного исходного материала (геномная ДНК, плазмидная ДНК, ампликоны) и для различных задач (геномное секвенирование de novo, ресеквенирование, таргетное секвенирование, мультиплексное секвенирование и т.д.). Процесс пробоподготовки заключается в достройке концов ДНК, пришивке 3’-концевой dA и лигировании к ней адаптеров.

Особенности набора

время пробоподготовки	60 минут
требуемое количество ДНК	1000 нг двухцепочечной ДНК
необходимость ПЦР	нет
фрагментация ДНК	опциональная, рекомендуется при количестве исходной ДНК менее 500 нг
длина рида	зависит от длины исходных фрагментов
производительность	2 гигабазы и более за 6 часов, 8 гигабаз и более за 48 часов
совместимые протоколы	Ligation Sequencing; Premium whole genome amplification; Sequence capture *
количество библиотек	6
совместимость с проточными ячейками	FLO-MIN106D; FLO-MIN107

* Полные протоколы доступны на сайте www.nanoporetech.com для зарегистрированных пользователей-участников Nanopore Community.

Набор оптимизирован для высокопроизводительного секвенирования. Для максимальной производительности рекомендуется получать библиотеку из 100-200 фмоль высокомолекулярной ДНК. Также важна степень чистоты ДНК, загрязнения существенно снижают производительность. Рекомендуется использовать наноспектрофотометр для оценки степени чистоты ДНК по следующим критериям:

• A260/A280 = 1,8;
• А260/А230 = 2 - 2,2.

Можно секвенировать библиотеки, полученные с помощью Ligation Sequencing Kit из меньшего количества ДНК или ДНК низкого качества, но это существенно уменьшает производительность секвенирования. Частично можно улучшить библиотеку с помощью стадии ПЦР: происходит обогащение библиотеки при малом стартовом количестве ДНК, а также снижается влияние примесей за счёт разведения образца. Но, если ПЦР является неотъемлемой частью пробоподготовки, рекомендуется использовать PCR Sequencing Kit или Rapid PCR Barcoding Kit.

Аналогично, если планируется регулярно секвенировать ампликоны или кДНК, рекомендуется использовать соответствующие наборы — PCR Sequencing Kit или, для секвенирования кДНК, cDNA-PCR Sequencing Kit и Direct cDNA Sequencing Kit.

Набор Ligation Sequencing Kit может быть использован для мультиплексного секвенирования. Для этого необходимы дополнительные наборы Native Barcoding Expansion 1-12 и 13-24 (для мультиплексирования без стадии ПЦР) или PCR Barcoding Expansion 1-12 и 1-96 (для мультиплексирования со стадией ПЦР).

Дополнительные расходные материалы и реактивы:

• магнитные частицы Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter);
• набор для достройки концов ДНК NEBNext End repair / dA-tailing Module (New England Biolabs E7546);
• ДНК-лигаза NEBNext Quick Ligation Module (New England Biolabs E6056);
• 1,5 мл пробирки типа Эппендорф с низкой адгезивностью DNA LoBind (Eppendorf 0030108051);
• 0,2 мл тонкостенные пробирки для ПЦР (Axygen PCR-02-C);
• вода, не содержащая нуклеаз (Thermo Fisher Scientific R0581);
• свежеприготовленный 70% этанол.

Опционально:

• набор для репарации ДНК NEBNext FFPE Repair Mix (New England Biolabs M6630);
• пробирки для фрагментации ДНК Covaris g-TUBE.

Дополнительное оборудование:

• настольная микроцентрифуга (например, Eppendorf 5452000018);
• вортекс (например, Biosan BS-010203-AAG);
• магнитный штатив (Диаэм 3336);
• ротационный перемешиватель (например, Elmi RM1L);
• амплификатор (например, Thermo Fisher Scientific A37834);
• набор автоматических пипеток переменного объёма — от 0,5 до 10 мкл (например, Eppendorf 3120000020), от 2 до 20 мкл (например, Eppendorf 3120000038), от 10 до 100 мкл (например, Eppendorf 3120000046), от 20 до 200 мкл (например, Eppendorf 3120000054) и от 100 до 1000 мкл (например, Eppendorf 3120000062);
• наконечники с фильтром к автоматическим пипеткам;
• термоконтейнер со льдом;
• таймер (например, TR118OS).

Опционально:

• флуориметр Qubit 4.0 (Thermo Q33227);
• система для фрагментного анализа (например, Qsep 100);
• наноспектрофотометр (например, NanoDrop 2000C);
• система для препаративного электрофореза BluePippin.

Набор для секвенирования кДНК со стадией ПЦР PCR-cDNA Sequencing Kit предназначен для секвенирования РНК через стадию синтеза кДНК с последующей ПЦР. С помощью набора PCR-cDNA Sequencing Kit можно:

• работать с ограниченным количеством стартового материала;
• оптимизировать ход эксперимента для получения максимальной производительности;
• исследовать дифференциальную экспрессию генов;
• характеризовать транскрипционные изоформы, варианты с альтернативным спласингом и фьюжн-транскрипты;
• секвенировать полноразмерные кДНК и анализировать их количество.

В состав набора входит Pro Flow Cell Priming Kit для загрузки библиотек в ячейку, совместимый с ячейками для PromethION

Особенности набора:

время пробоподготовки	от 165 минут
требуемое количество ДНК	1 нг полиА + РНК или 50 нг суммарной РНК
необходимость обратной транскрипции	да
необходимость ПЦР	да
длина рида	равна длине полных транскриптов
производительность	3 гигабазы и более за 6 часов, до 8 гигабаз и более за 48 часов
число ридов	7-12 миллионов и более полноразмерных кДНК
мультиплексирование	с PCR Barcoding Expansion Pack (SQK-PBK004)
совместимые протоколы	cDNA-PCR sequencing
количество библиотек	6
совместимость с проточными ячейками	FLO-MIN106D; FLO-PRO002 (PromethION)

Набор рассчитан на работу с минимальным количеством поли-А+ РНК, для получения библиотеки достаточно всего 1 нг. В случае невозможности выделения полиА+-фракции допустимо использование суммарной РНК (рекомендуется не менее 50 нг), но в этом случае требуется оптимизация пробоподготовки.

Пробоподготовка заключается в синтезе комплементарной цепи кДНК с помощью обратной транскрипции. Обогащение библиотеки полноразмерными копиями происходит за счёт переключения цепей при обратной транскрипции (strand-switching). Затем происходит синтез двухцепочечной кДНК с помощью ПЦР, в реакции используются специфические праймеры для последующего безлигазного присоединения сиквенсных адаптеров.
При работе с PCR-cDNA Sequencing Kit предусмотрена возможность мультиплексирования с помощью набора PCR Barcoding Expansion (SQK-PBK004). В одну библиотеку может быть загружено до 12 образцов кДНК.

Дополнительные расходные материалы и реактивы:

• магнитные частицы Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter);
• мастер-микс для ПЦР LongAmp Taq 2x (New England Biolabs M0287);
• 1,5 мл пробирки типа Эппендорф с низкой адгезивностью DNA LoBind (Eppendorf 30108051);
• 0,2 мл тонкостенные пробирки для ПЦР (Axygen PCR-02-C);
• вода, не содержащая нуклеаз (Thermo Fisher Scientific R0581);
• свежеприготовленный 70% этанол;
• 10 мМ раствор dNTP (Thermo Fisher Scientific R0191);
• обратная транскриптаза Maxima H Minus (Thermo Fisher Scientific EP0751);
• ингибитор РНКаз RNAseOUT (Thermo Fisher Scientific 10777019).

Дополнительное оборудование:

• настольная микроцентрифуга (например, Eppendorf 5452000018);
• вортекс (например, Biosan BS-010203-AAG);
• магнитный штатив (Диаэм 3336);
• ротационный перемешиватель (например, Elmi RM1L);
• амплификатор (например, Thermo Fisher Scientific A37834);
• набор автоматических пипеток переменного объёма - от 0.5 до 10 мкл (например, Eppendorf 3120000020), от 2 до 20 мкл (например, Eppendorf 3120000038), от 10 до 100 мкл (например, Eppendorf 3120000046), от 20 до 200 мкл (например, Eppendorf 3120000054) и от 100 до 1000 мкл (например, Eppendorf 3120000062);
• наконечники с фильтром к автоматическим пипеткам;
• термоконтейнер со льдом;
• таймер (например, TR118OS);
• охлаждающий штатив для пробирок на 0,2 мл (например, Eppendorf 3881000031).

Опционально:

• флуориметр Qubit 4.0 (Thermo Q33227);
• система для фрагментного анализа (например, Qsep 100);
• наноспектрофотометр (например, NanoDrop 2000C).

Карманный компьютер с предустановленными Linux OS и MinKNOW, предназначен для работы с секвенатором MinION как дополнение или альтернатива персональному компьютеру. Процесс также может контролироваться через Bluetooth с ноутбука, планшета или смартфона.