Экзосомы: выделение и анализ

Антиген CD63 — это белок, относящийся к суперсемейству трансмембранных белков, или иначе к семейству тетраспанинов. Как правило многие из этого семейства белков — это белки клеточной поверхности, основная характеристика которых это наличие 4-х гидрофобных доменов. Белки предопределяют события передачи сигналов, играющих важное значение в процессах регуляции развития, активации, роста и подвижности клеток. CD63 — это гликопротеин клеточной поверхности, как известно, образующий комплекс с интегринами. CD63 в основном связан с мембранами внутриклеточных везикул: эндосомы, лизосомы и экзосомы.

Характеристики

• Синонимы — CD63, LAMP-3, ME491, MLA1, OMA81H, TSPAN30, молекула CD63, ассоциированный с лизосомами мембранный белок 3, LAMP3, антиген CD63, NGA, тетраспанин-30;
• иммуноген — рекомбинантный белок, соответствующий CD63 человека;
• очистка — аффинная хроматография;
• применение — вестернблот, ИГХ, иммунофлуоресценция; человек;
• молекулярный вес, предсказанный / наблюдаемый — 26 кДа / 25-60 кДа.

Хранение при температуре -20 °C в течение одного года. Избегайте повторных циклов замораживания/оттаивания.

Буфер для хранения PBS с 0,15% ProClin300, 100 мкг/мл BSA и 50% глицерина.

• Иммуноцитохимическое окрашивание CD63(GB115694) красный.
• Образец: A431, 4% PFA (G1101) 20 мин.
• Блокирующий буфер: 3% BSA (GC305010) в PBS, RT, 30 мин.
• Первичное антитело: 1:1500, 4 °C в течение ночи.
• Вторичное антитело: Cy3 конъюгированное козье антикроличье IgG (H+L) (GB21303), 1: 300, RT, 1 ч.

Hsp70 принадлежит к группе белков теплового шока 70, которые играют важную роль в реакциях клеток на стресс. Эти белки получили свое название из-за повышенной экспрессии в ответ на тепловой шок, но они также участвуют в различных других стрессовых состояниях, включая окислительный стресс, воздействие тяжелых металлов и многое другое. Вместе с другими белками этой группы данный белок отвечает за стабильность существующих белков от процесса агрегации и обеспечивает сворачивание новых транслированных белков в цитозоле и органеллах. Hsp70 в том числе принимает участие в убиквитин-протеасомном пути посредством реагирования с насыщенным AU элементом РНК-связывающего белка 1. Ген располагается в части главного комплекса гистосовместимости класса III, в кластере с двумя близкородственными генами, кодирующих аналогичные белки.

Характеристики

• Синонимы — HSP70-1, HSP70.1, HSPA1, HSP72, Heat Shock 70 KDa Protein 1;
• иммуноген — рекомбинантный белок, соответствующий человеческому HSP70;
• очистка — аффинная хроматография;
• применение — вестернблот, ИГХ, иммунофлуоресценция; человек, мышь, крыса;
• молекулярный вес, (кДа), предсказанный / наблюдаемый — 70/70.

Хранить при -20 °C один год. Избегать повторных процессов замораживания/оттаивания.

Буфер для хранения — PBS с 0,02% азида натрия, 100 мкг/мл BSA и 50% глицерина.

• Вестерн блот анализ HSP70 (GB15244).
• Образец: белок, обработанный лизирующим буфером RIPA (G2002).
• Блокирующий буфер: 3% обезжиренное сухое молоко (GC310001) в TBST, RT, 1 ч.
• Первичное антитело: 1:2000, 4 °C в течение ночи.
• Вторичное антитело: конъюгированное с HRP козье антикроличье IgG (H+L) (GB23303), 1:3000, RT, 1 ч.

TSG101 принадлежит к группе неактивных гомологов убиквитин-конъюгирующих ферментов. Продукт гена содержит домен спирали, который взаимодействует со статмином, цитозольным фосфопротеином, вовлеченным в онкогенез. Белок может играть роль в росте и дифференциации клеток и действовать как отрицательный регулятор роста. Как компонент комплекса ESCRT-I, регулирует процессы везикулярного транспорта, связывается с убиквитинированными белками-грузами и требуется для сортировки эндоцитарных убиквитинированных грузов в мультивезикулярные тельца (MVB). Участвовует в росте и дифференцировке клеток, действуя как отрицательный регулятор роста. Требуется для экзосомального высвобождения SDCBP, CD63 и синдекана.

Характеристики

• Синонимы — TSG10, TSG101, субъединица комплекса ESCRT I TSG101, маркер экзосом;
• иммуноген — синтетический пептид, конъюгированный с KLH, соответствующий мышиному TSG101 (N-конец);
• очистка — аффинная хроматография;
• применение — вестернблот, человек, мышь, крыса;
• молекулярный вес, (кДа), предсказанный / наблюдаемый — 44/46.

Хранение при температуре -20 ℃ в течение одного года. Избегайте повторных циклов замораживания/оттаивания.

Буфер для хранения — PBS с 0,02% азида натрия, 100 мкг/мл BSA и 50% глицерина.

• Вестерн блот анализ TSG101 (GB11618).
• Образец: белок, обработанный лизирующим буфером RIPA (G2002).
• Блокирующий буфер: 3% обезжиренное сухое молоко (GC310001) в TBST, RT, 1 ч.
• Первичное антитело: 1:500, 4 ℃ в течение ночи.
• Вторичное антитело: конъюгированное с HRP козье антикроличье IgG (H+L) (GB23303), 1:3000, RT, 1 ч.

CD9 — это трансмембранный белок 24 кДа типа III, также известный как тетраспанин, MRP-1 и DRAP-24. Он является членом семейства тетраспанов, обнаруженных на тромбоцитах, предшественниках В-клеток, активированных лимфоцитах, гранулоцитах, эндотелиальных клетках и эпителиальных клетках. CD9 индуцирует адгезию, агрегацию тромбоцитов и развитие В-клеток. Было показано, что CD9 ассоциируется с CD63, CD81, CD82 и CD36 и связывается с интегринами β1.

Характеристики

• Синонимы — 5H9, антиген 5H9, BA2, BTCC 1, CD9, маркеры клеток и органелл, DRAP 27, маркер экзосом, GIG2, лейкоцитарный антиген MIC3, MIC3, MRP 1, P24, тетраспанин 29, Tspan 29, TSPAN29;
• иммуноген — конъюгированный с KLH синтетический пептид, соответствующий человеческому CD9;
• очистка — аффинная хроматография;
• применение — вестернблот, ИГХ, иммунофлуоресценция; человек;
• молекулярный вес, ( кДа), предсказанный / наблюдаемый — 25 / 22-27.

Хранение при температуре -20 ℃ в течение одного года. Избегайте повторных циклов замораживания/оттаивания.

Буфер для хранения — PBS с 0,15% ProClin300, 100 мкг/мл BSA и 50% глицерина.

• Вестерн блот анализ CD9 (GB115697).
• Образец: белок, обработанный лизирующим буфером RIPA (G2002).
• Блокирующий буфер: 3% обезжиренное сухое молоко (GC310001) в TBST, RT, 1 ч.
• Первичное антитело: 1:500, 4 ℃ в течение ночи.
• Вторичное антитело: конъюгированное с HRP козье антикроличье IgG (H+L) (GB23303), 1:3000, RT, 1 ч.

Колонка хроматографическая для выделения экзосом работает по принципу эксклюзионной хроматографии (гель-фильтрации), специально адаптирована для быстрого выделения экзосом из культуральной жидкости или сыворотки/плазмы. Преимущества данного метода выделения заключаются в том, что в результате, получается выделить высокочистые экзосомы и эффективно удалить белки. Кроме того данный метод предотвращает повреждение мембран экзосом, которое нередко происходит при воздействии сверхвысокой центробежной силы при традиционных методах ультрацентрифугирования.

Перед выделением из культуральной жидкости экзосомы предварительно требуется сконцентрировать. В состав набора уже включен специальный буфер для концентрирования. Для этого этапа потребуется центрифуга с охлаждением на 10 000×g.

Выделение экзосом с помощью колонок не требует дополнительного оборудования, достаточно иметь PBS, стерильный раствор 0,1 М NaOH комнатной температуры и 20% этанол. Предварительно сыворотку или плазму рекомендуется отфильтровать через мембрану 0,22 мкм. Колонка пригодна для повторного использования, допускается до 5 выделений.

Транспортировка и хранение колонки — при комнатной температуре, 12 месяцев.

Колонка хроматографическая для выделения экзосом работает по принципу эксклюзионной хроматографии (гель-фильтрации), специально адаптирована для быстрого выделения экзосом из культуральной жидкости или сыворотки/плазмы. Преимущества данного метода выделения заключаются в том, что в результате, получается выделить высокочистые экзосомы и эффективно удалить белки. Кроме того данный метод предотвращает повреждение мембран экзосом, которое нередко происходит при воздействии сверхвысокой центробежной силы при традиционных методах ультрацентрифугирования.

Выделение экзосом с помощью колонок не требует дополнительного оборудования, достаточно иметь PBS, стерильный раствор 0,1 М NaOH комнатной температуры и 20% этанол. Предварительно сыворотку или плазму рекомендуется отфильтровать через мембрану 0,22 мкм. Колонка пригодна для повторного использования, допускается до 5 выделений.

Транспортировка и хранение колонки — при комнатной температуре, 12 месяцев.

Экзосомы — это мембранные везикулы с размером частиц от 30 до 150 нм, активно секретируемые клетками во внеклеточное пространство. При больших объемах жидкости, например, культуральной среды, наблюдается низкая концентрация экзосом и их выделение может стать утомительным, неспецифическим и сложным процессом.

Раствор для концентрирования экзосом обеспечивает простой и надежный способ для концентрирования экзосом из кондиционной среды с помощью протокола, масштабируемого в зависимости от размера образца. Такой концентрированный раствор можно использовать для дальнейшего выделения, в том числе в хроматографической колонке для выделения экзосом G4112-5.

Транспортировка и хранение при комнатной температуре. Срок годности 12 месяцев.

Система Exodus — это автоматизированное, безметочное и высокоэффективное решение для выделения экзосом. Принцип работы системы основан на сочетании двухмембранной нанофильтрации с колебаниями отрицательного давления и гармоническими колебаниями.

Периодические колебания отрицательного давления выполняют две важные функции. Во-первых, отрицательное давление, приложенное к мембране, позволяет удалять примеси, такие как белки, нуклеиновые кислоты и жидкости, которые меньше экзосом, проходя через нанопоры мембраны. Во-вторых, когда давление возвращается к атмосферному уровню, мгновенная вибрация мембраны вызывает ресуспендирование частиц, прикрепленных к ее внутренней поверхности. Эти частицы, будучи крупнее нанопор мембраны, впоследствии задерживаются в центральной камере.

Кроме того, в систему нанофильтрации включены двойные связанные ультразвуковые гармонические колебания для генерации поперечных волн, усиливающих вибрацию мембраны. Эта вибрация высвобождает частицы, прилипшие к поверхности мембраны, обратно во взвешенное состояние, эффективно предотвращая агрегацию частиц и засорение мембраны.

Такой процесс выделения экзосом обеспечивает высокую производительность, выход и чистоту.

По данному методу была опубликована статья в журнале Natural Methods в 2021 году. С момента своего запуска система Exodus широко используется для обработки различных типов биологических жидкостей в широком диапазоне объемов образцов.

Для обеспечения плавного перехода клиентов от исследований к коммерческому производству компания Exodus Bio предлагает масштабируемое решение для автоматической изоляции экзосом. Система включает три модели: H-300, для обработки образцов от 10 мкл до 50 мл, что делает ее идеальной для исследовательских и клинических применений. H-600 может обрабатывать объемы до 250 мл, и является оптимальной для исследований и разработки продукции. Наконец, T2800 подходит для производства в соответствии со стандартами GMP и эффективно обрабатывает объемы образцов до 10 л.

Преимущества систем для выделения экзосом Exodus

• Использование одноразовых расходных материалов;
• полная автоматизация процесса;
• значительное сокращение ручных манипуляций и времени выделения;
• простота в эксплуатации;
• подходит для различных типов образцов;
• высокий выход экзосом;
• степень восстановления экзосом более 90%;
• удаление примесных белков более 99%

Технические характеристики систем для выделения экзосом Exodus H-300 и Exodus H-300

Расходные материалы для систем Exodus представляют собой специальные одноразовые картриджи на различные объемы 15, 50 и 250 мл с размерами пор 30 и 70 нм, возможны кастомные заказы для создания специальных картриджей под свои уникальные задачи.

Система Exodus — это автоматизированное, безметочное и высокоэффективное решение для выделения экзосом. Принцип работы системы основан на сочетании двухмембранной нанофильтрации с колебаниями отрицательного давления и гармоническими колебаниями.

Периодические колебания отрицательного давления выполняют две важные функции. Во-первых, отрицательное давление, приложенное к мембране, позволяет удалять примеси, такие как белки, нуклеиновые кислоты и жидкости, которые меньше экзосом, проходя через нанопоры мембраны. Во-вторых, когда давление возвращается к атмосферному уровню, мгновенная вибрация мембраны вызывает ресуспендирование частиц, прикрепленных к ее внутренней поверхности. Эти частицы, будучи крупнее нанопор мембраны, впоследствии задерживаются в центральной камере.

Кроме того, в систему нанофильтрации включены двойные связанные ультразвуковые гармонические колебания для генерации поперечных волн, усиливающих вибрацию мембраны. Эта вибрация высвобождает частицы, прилипшие к поверхности мембраны, обратно во взвешенное состояние, эффективно предотвращая агрегацию частиц и засорение мембраны.

Такой процесс выделения экзосом обеспечивает высокую производительность, выход и чистоту.

По данному методу была опубликована статья в журнале Natural Methods в 2021 году. С момента своего запуска система Exodus широко используется для обработки различных типов биологических жидкостей в широком диапазоне объемов образцов.

Для обеспечения плавного перехода от исследований к коммерческому производству компания Exodus Bio предлагает масштабируемое решение для автоматической изоляции экзосом. Система включает три модели: H-300, для обработки образцов от 10 мкл до 50 мл, что делает ее идеальной для исследовательских и клинических применений. H-600 может обрабатывать объемы до 250 мл, и является оптимальной для исследований и разработки продукции. Наконец, T-2800 подходит для производства в соответствии со стандартами GMP и эффективно обрабатывает объемы образцов до 10 л.

Преимущества системы автоматического выделения экзосом, Exodus T-2800

• Использование одноразовых расходных материалов;
• полная автоматизация процесса;
• контроль временных и количественных параметров;
• сокращение ручных манипуляций;
• простота в эксплуатации;
• высокий выход экзосом;
• эффективное восстановление экзосом после выделения, >90%;
• высокая степень удаления примесных белков;
• соответствие протоколам GMP.

Технические характеристики системы автоматического выделения экзосом, Exodus T-2800

• Объем образца, л — 1-10;
• скорость процесса, л/час — 1-2;
• удаление примесных белков, % — 99;
• концентрация экзосом на выходе, количество частиц/мл — 1×10¹¹-1×10¹², в зависимости от образца и программы выделения;
• температурный контроль,°С — 2-8;
• интерфейс — 10,4 -дюймовый тачскрин, система управления без компьютера;
• размер (Ш×Д×В), мм — 500×820×685;
• вес, кг — 90.

Для выделения используется полностью закрытый кит в соответствии с фармакопейными стандартами: стерильный и без эндотоксинов. Кит для системы Exodus T-2800 варьирует в зависимости от требуемого объема выделения и размер пор. Также возможны кастомные заказы для создания специальных картриджей под свои уникальные задачи.

Система 3D FloTrix vivaEXO, разработанная компанией CytoNiche позволяет выделять экзосомы без длительного ультрацентрифугирования. В основе работы системы лежит принцип многоступенчатого разделения и фильтрации и позволяет выделять экзосомы из большого объема среды — до 30 л. Прибор разработан в соответствии с требованиями к получению клеточного продукта, поскольку использует одноразовую закрытую упаковку расходных материалов и соответствует фармацевтическим стандартам GMP. Система может точно записывать и контролировать все параметры в процессе выделения в режиме реального времени с помощью дружественного интерфейса.

Преимущества системы для сбора экзосом 3D FloTrix vivaEXO

• Использование одноразовых расходных материалов;
• процесс полностью автоматический;
• контроль временных и количественных параметров;
• сокращение ручных манипуляций;
• можно подключать напрямую к биореактору;
• соответствие протоколам GMP.

Особенности системы для сбора экзосом 3D FloTrix vivaEXO

• Позволяет обработать 10 л исходного раствора за 2 часа;
• 10 л исходного раствора можно сконцентрировать до 500 мл;
• объем обрабатываемой жидкости одним модулем 10-30 литров;
• минимальный объем обрабатываемого раствора 2 литра;
• соответствие GMP:
• встроенная функция контрольного журнала;
• вход пользователя и многоуровневое управление полномочиями;
• целостность и отслеживаемость данных;
• регистрация в режиме реального времени данных, операций и информации о сигналах тревоги, которые невозможно удалить;
• экспортируемые записи.

Технические характеристики системы для сбора экзосом 3D FloTrix vivaEXO

• Диапазон сенсора веса, кг — 0-30;
• чувствительность датчика веса, мВ/В — 1,0-2,0 ±1,0;
• интерфейс — 7-дюймовый тачскрин;
• диапазон скорости перистальтической помпы, об/мин — до 600;
• размеры (Д×В×Ш), мм — 865×695×386;
• вес, кг — 40.

Для работы системы необходимо использование одновременно двух одноразовых модулей: PUR02 и CLR. Модуль CLR нужен для фильтрации примесей крупных частиц, а модуль PUR непосредственно для концентрации и очистки экзосом. Кроме того, модуль R011-PUR-03 можно использовать повторно, несколько раз при правильном обращении и регенерации.

Состав системы для сбора экзосом 3D FloTrix vivaEXO: